Časové hradlování

Nový alternativní přístup k překonávání autofluorescence, na němž pracuje Dr. Beeby, obsahuje využití časového filtrování namísto techniky filtrování pomocí vlnových délek. Fluorescenční doba autofluorescence ze vzorku je typicky v řádu několika nanosekund, tj. jestliže je vzorek excitován velmi krátkým světelným impulsem, intenzita fluorescence za dobu několika nanosekund dozní. Skupina z Durhamu vyvíjí luminiscenční sondy, které mají mnohem delší dobu dosvitu, což umožňuje rozlišení záření z pozadí od záření sondy.
Jedním jednoduchým způsobem, jak toho dosáhnout, je použít „hradlovacího“ detektoru synchronizovaného se zdrojem excitace. Zesilovače hradlovaného obrazu se využívá jako rychlé závěrky, která je schopna se otevřít nebo zavřít za 5 nanosekund, což umožňuje, aby záření zformovalo definovaný časový úsek, jehož se má dosáhnout. Provádí-li se podobné měření bez časového hradlování, je zesilovač trvale zapnut a veškeré záření je vidět. Zesílený obraz se nahrává pomocí nízkonákladové chlazené CCD kamery, která má rozhraní do PC pro získávání a analýzu obrazů.

S byužitím této techniky Beeby a kol.1  prokázali, že luminiscenční sondu nebo značku s dlouhou dobou dosvitu lze zjistit s velkou citlivostí proti vysoce fluorescenčnímu pozadí, jak ilustruje obr. 1.

Obr. 1 ilustruje sílu časově rozloženého zobrazení. K luminiscenčním barvivům použitým pro bezpečnostní účely na tuto desetieurovou bankovku patří komplexy europia. V tomto příkladu je mikroskopem zobrazena malá oblast a obraz je zaznamenán po excitaci laserem Nd:YAG (355nm): obraz vlevo je se zpožděním 0ns a hradlovacím impulsem 1µs a ukazuje silnou  fluorescenci z „modrého“ pozadí, zatímco vpravo je zaznamenán se zpožděním 10µs a hradlovacím impulsem 100µs. Významné je, že se zde ukazuje pouze fosforescence z chelátu europia (kruk kolem hvězdičky je skutečný). ).

Obr. 2. Uvedená spektra byla získána z modré části vlajky na eurobankovce z obr. 1 (zelená čára) a z jedné ze žlutých hvězdiček (červená čára) pomocí rtuťové lampy s filtrem WU excitace. Na posledně jmenovaném je vidět charakteristické spektrum komplexu europia.

“Všechny položky jsme vybírali jako samostatné kvůli maximální univerzálnosti a výkonnosti,“ řekl Dr. Beeby. „Lasery a lampy jsme již měli z dřívějších experimentů. Ale vybrali jsme si IX71 od firmy Olympus, protože jsme byli obeznámeni s výkonností této firmy a protože měli vynikající optiku a dobré ceny. Když jsme ho zkombinovali se zesilovačem hradlovaného obrazu od výrobce Photek Ltd (Velká Británie), zjistili jsme, že naše modulární jednotka je jednoduchá a univerzální.“
“Museli jsme všechny komponenty mikroskopového systému vzájemně propojit. To zahrnuje strojní části, elektroniku i optiku. Jsme šťastní, že u nás v Durhamu nám naše strojní a elektronické dílny poskytují vynikající technickou podporu. Nakonec bude celý systém ovládán z jediného PC pomocí softwaru od firmy LabVIEW.“ Ovladače pro mikroskopy Olympus BX2 a IX2 od firmy LabView poskytují webové stránky National Instruments.

Sondy

Klíčovým faktorem, který stojí v pozadí úspěchu tohoto systému, je volba luminiscenčních látek neboli  molekulárních sond. Ionty lanthanidů je obtížné přímo excitovat kvůli jejich špatné schopnosti absorbovat světlo. Ale když se tyto ionty zkombinují s organickým ligandem obsahujícím anténu, např. akridonem, lze je účinně učinit citlivými, aby vydávaly luminiscenci.
Skupina plánuje, že pomocí mikroskopie s vysokým rozlišením bez fluorescence z pozadí získá mapy záření sond na bázi lanthanidů, což umožní sledovat i malé buněčné události, jako je subcelulární organizace.

“Systém již v biologii vypadá slibně,“ řekl Dr. Beeby. „Můj kolega, profesor David Parker z katedry chemie zde v Durhamu konstruuje citlivé lanthanidové sondy, které nám umožní zmapovat lokální koncentrace iontů např. hydrogenuhličitanu a dalších důležitých buněčných složek. Ve spojení s našimi kolegy z katedry biologie prokázali, že komplexy pronikají do buněk.“ Důležité je, že profesor Parker zjistil, že lanthanidy nejsou pro živé buňky toxické, což ostatním biologům otevírá cestu k používání téže metody molekulárního zobrazování. 

Sledování molekulárních změn

Změny v koncentracích hydrogenuhličitanu v savčích buňkách se dávají do souvislosti s řadou nádorů, mentální retardací, renální tubulární acidózou a osteoporézou. Přesto dosud existuje jen velmi málo metod, které mohou vysvětlit, co a jak změny v koncentraci spouští.
V souvislosti se snahou o nalezení nových metod měření komponentů ve vnitrobuněčném prostředí i externím prostředí buňky profesor Parker uvedl, že lanthanidové komplexy selektivně reagují na ionty hydrogenuhličitanu v buňce. Známkou přítomnosti tohoto analytu v prostředí by byla změna v komplexu, který způsobuje změnu v intenzitě, spektru a době dosvitu záření.
Vzhledem ke sledování vyzařování lanthanidů při až třech vlnových délkách lze doufat, že metoda umožní vyvodit koncentraci hydrogenuhličitanu oproti dalším konkurenčním iontům, např. laktátu, citrátu a fosfátu.

Budoucí trendy

Skupina z Durhamu doufá, že rozšíří svou sbírku sond na bázi lanthanidů, aby mohla provádět několik zkoušek zároveň. V plném proudu jsou rovněž studie zkoumající využití lanthanidů pro klinickou chemii, zejména ke zkouškám na drogy.

¹ Beeby A, Botchway SW, Clarkson IM, Faulkner S, Parker AW, Parker D, Williams JA.
Luminescence imaging microscopy and lifetime mapping using kinetically stable lanthanide(III) complexes. (Mikroskopie luminiscenčního zobrazování a mapování doby dosvitu pomocí kineticky stabilních komplexů lanthanidu (III).) J Photochem Photobiol B. 2000 Sep; 57(2-3):83-9.